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A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica que fotocopia um fragmento de DNA em muitos fragmentos - exponencialmente muitos. O primeiro passo da PCR é aquecer o DNA para que ele desnature ou derreta em fios simples. A estrutura do DNA é como uma escada de corda na qual os degraus são cordas com extremidades magnéticas. Os ímãs se conectam para formar os degraus, chamados pares de bases, e, portanto, resistem a serem separados. Cada fragmento de DNA derrete em cordões únicos a diferentes temperaturas. Compreender como a estrutura do DNA é mantida unida pelas partes individuais do DNA dará uma ideia de por que diferentes fragmentos de DNA derretem a diferentes temperaturas e por que são necessárias temperaturas tão altas em primeiro lugar.
Derretendo! Derretendo!
O primeiro passo da PCR é derreter o DNA para que o DNA de fita dupla se separe no DNA de fita única. Para o DNA de mamíferos, esse primeiro passo geralmente envolve calor de aproximadamente 95 graus Celsius (cerca de 200 Fahrenheit). A essa temperatura, as ligações de hidrogênio entre os pares de bases A-T e G-C, ou degraus na escada de DNA, se separam, descompactando o DNA de fita dupla. No entanto, a temperatura não é quente o suficiente para quebrar a espinha dorsal do açúcar fosfato que forma os fios simples ou os pólos da escada. A separação completa de cordões únicos os prepara para o segundo passo da PCR, que é o resfriamento para permitir que fragmentos curtos de DNA, chamados iniciadores, ligem os cordões únicos.
Fechos magnéticos
Uma das razões pelas quais o DNA é aquecido à alta temperatura de 95 graus Celsius é que, quanto mais longa a fita dupla do DNA, mais ele deseja permanecer junto. O comprimento do DNA é um fator que afeta o ponto de fusão escolhido para a PCR nesse pedaço de DNA. Os pares de bases A-T e G-C na ligação de DNA de fita dupla entre si para manter a estrutura de fita dupla unida. Quanto mais pares de bases consecutivos entre dois fios simples se unirem, mais os vizinhos também desejam se unir e mais forte será a atração entre os dois fios. É como um zíper feito de pequenos ímãs. Quando você fecha o zíper, os ímãs naturalmente querem fechar o zíper e permanecer zipados.
Ímãs mais fortes ficam mais firmes
Outro fator que afeta a temperatura de fusão a ser escolhida para o seu fragmento de DNA de interesse é a quantidade de pares de bases G-C presentes nesse fragmento. Cada par de bases é como dois mini-ímãs que atraem. Um par feito de G e C é muito mais atraído do que um par A e T. Assim, um pedaço de DNA que possui mais pares G-C do que outro fragmento exigirá uma temperatura mais alta antes de se fundir em fios simples. O DNA absorve naturalmente a luz ultravioleta - no comprimento de onda de 260 nanômetros, para ser exato - e o DNA de fita simples absorve mais luz do que o DNA de fita dupla. Portanto, medir a quantidade de luz absorvida é uma maneira de medir quanto seu DNA de fita dupla derreteu em fitas simples. O efeito "zíper magnético" dos pares de bases G-C e A-T é o que faz com que um gráfico da absorvância da luz do DNA de fita dupla, plotado contra um aumento de temperatura, seja sigmoidal, em forma de S e não em linha reta. A curva do S representa a resistência do trabalho em equipe que os pares de bases exercem contra o calor porque não desejam separar.
O ponto intermediário
A temperatura na qual um comprimento de DNA derrete em cordões únicos é chamada de temperatura de fusão, que é denotada pela abreviatura "Tm". Isso indica a temperatura na qual metade do DNA em uma solução derreteu em cordões únicos e a outra metade é ainda em forma de fita dupla. A temperatura de fusão é diferente para cada fragmento de DNA. O DNA de mamíferos tem um conteúdo de G-C de 40%, o que significa que os 60% restantes dos pares de bases são As e Ts. Seu conteúdo de 40% de G-C faz com que o DNA de mamíferos derreta a 87 graus Celsius (cerca de 189 Fahrenheit). É por isso que o primeiro passo da PCR no DNA de mamíferos é aquecê-lo a 94 graus Celsius (201 Fahrenheit). Apenas sete graus mais quentes que a temperatura de fusão e todos os fios duplos derreterão completamente em fios únicos.