Contente
Ao trabalhar com cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), uma boa calibração é absolutamente essencial para garantir resultados confiáveis e de qualidade. A calibração adequada de um instrumento HPLC começa com a criação de um padrão de calibração adequado. Na maioria dos casos, a calibração de fato exige uma série de padrões de aumento da concentração para produzir o que é conhecido como curva de calibração. Esta é uma linha plotada e uma equação associada que descreve a relação entre a concentração do produto químico que está sendo testado e a resposta do detector de HPLC.
Determine o produto químico que você deseja testar usando a HPLC (o "analito"). Por exemplo, você pode testar uma série de refrigerantes quanto ao teor de frutose, caso em que a frutose seria o analito.
Obter uma quantidade do produto químico analito de pureza adequada. Normalmente, a pureza deve estar acima de 99% e o analito deve ser adquirido de uma empresa de fornecimento de produtos químicos respeitável. No caso da frutose, por exemplo, você compraria frutose pura de um fornecedor de produtos químicos e não de um supermercado.
Determine as concentrações máximas e mínimas previstas do analito nas amostras que você pretende testar no HPLC. No caso de refrigerantes, você examinaria os rótulos das bebidas e determinaria o menor e o maior teor de frutose entre as bebidas que testará. Lembre-se de que a amostra inicial (o refrigerante) pode ser diluída ou manipulada durante a preparação para a análise (dependendo do método de HPLC utilizado) e, portanto, a concentração do analito nas amostras realmente injetadas na HPLC pode ser modificada. É a concentração do analito nas amostras, executada no HPLC, que deve ser considerada.
Determine o solvente no qual você dissolverá o analito para compor os padrões de calibração. Esse solvente deve ser capaz de dissolver adequadamente o analito em uma faixa de concentração relativamente ampla (pelo menos, tão alta quanto nas amostras que você pretende testar). Além disso, esse solvente deve idealmente ser bastante semelhante à "fase móvel": o solvente usado para transportar amostras através do instrumento HPLC.
Calcule a quantidade de analito necessária para criar uma solução "padrão de estoque" do analito. Isso é encontrado multiplicando a concentração necessária do padrão de estoque pelo volume desejado. A concentração do analito nesta solução deve ser pelo menos 10% maior que a maior concentração prevista da amostra. Se a maior concentração prevista de frutose em uma amostra de refrigerante for 8 gramas / 100 mililitros, o padrão de estoque poderá ser estabelecido para uma concentração de 10 gramas de frutose / 100 mililitros. Um volume razoável é de 500 mililitros, portanto, seria necessário 8/100 mL x 500 mL = 40 gramas de frutose.
Pesar a quantidade necessária de analito para um nível adequado de precisão. Freqüentemente, é adequado um valor de peso em gramas, com precisão de uma ou duas casas decimais, mas pode ser necessária mais precisão para alguns métodos.
Transfira o analito pesado para um balão volumétrico com o volume necessário e adicione o solvente desejado à marca de enchimento no balão. O uso de um balão volumétrico (em vez de um copo graduado, por exemplo) aumenta a precisão do valor padrão da concentração padrão. Garantir que todo o analito seja transferido para o balão; use um pouco do solvente para lavá-lo, se necessário.
Fechar o frasco volumétrico e agitar ou inverter suavemente até o analito estar completamente dissolvido.
Faça uma série de diluições variadas do padrão de estoque transferindo volumes conhecidos do padrão de estoque em frascos volumétricos, usando pipetas para transferência precisa e adicionando solvente. A concentração padrão mais baixa deve estar abaixo da amostra antecipada mais baixa a ser analisada. No exemplo de refrigerante, se a menor concentração esperada de frutose em uma amostra for 2 gramas / 100 mL, um padrão de 1 grama / 100 mL poderá ser feito. Isso seria feito por uma diluição de dez vezes o padrão das ações. A série padrão deve incluir um total de 5 ou 6 concentrações, portanto, diluições adicionais para produzir padrões de talvez 3, 5 e 8 gramas de frutose / mL seriam necessárias. Agora você tem uma série de soluções padrão para calibrar a HPLC.