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A cromatografia líquida de alta eficiência é uma técnica para a análise laboratorial de uma mistura. É um tipo eficiente de cromatografia que utiliza alta pressão, em vez de simplesmente gravidade, para impulsionar uma amostra de uma mistura através de uma coluna. Uma amostra é injetada e, em seguida, uma bomba contendo altas quantidades de pressão ajuda a mover a amostra ao longo de uma coluna compactada, onde é separada em componentes individuais. Essa separação é então analisada por um detector para produzir resultados.
Local de injeção
Para ser injetada em uma HPLC, uma amostra deve primeiro ser dissolvida em um solvente líquido polar, preferencialmente um com espectros conhecidos de HPLC, para que seus dados possam ser distinguidos das amostras. A solução líquida que contém a amostra é colocada no instrumento e enviada à coluna. A localização real do local da injeção depende da marca dos instrumentos. Na maioria dos casos, o processo de injeção é automatizado, mas em alguns casos um técnico de laboratório deve injetar a amostra usando uma pequena agulha de seringa.
Componente da bomba
O componente da bomba da unidade de HPLC é necessário porque fornece a pressão que impulsiona a amostra através da coluna. A força da bomba varia, mas uma pressão poderosa pode produzir uma pressão de até 6.000 psi, ou libras por polegada quadrada, que é aplicada após a injeção da amostra. Isso permite que a amostra passe pela coluna com mais rapidez e eficiência do que se ela pingasse usando apenas a força da gravidade.
Descrição da coluna
O aumento da velocidade de uma amostra passada através da coluna por uma bomba permite o uso de um tipo de coluna diferente daqueles usados na cromatografia líquida simples. O material de embalagem na coluna pode ter um tamanho de partícula muito menor, o que aumenta a área da superfície e, portanto, auxilia as interações da amostra com a coluna. A maioria das colunas de HPLC trabalha com polaridade. A amostra é dissolvida em um solvente polar e a coluna é composta principalmente de hidrocarbonetos não polares. As partes polares da molécula de amostra passam através da coluna muito rapidamente porque estão interagindo principalmente com o solvente, enquanto os componentes não polares das amostras permanecem na coluna, formando interações fracas com os componentes da coluna. Portanto, os componentes das amostras saem da coluna na ordem da mais polar para a não polar.
Função Detector
Os detectores também variam de acordo com o tipo de instrumento de HPLC que está sendo usado. No entanto, a maioria funciona da mesma maneira básica. Uma fonte de luz ultravioleta brilha nos componentes separados da amostra quando eles saem da coluna. A maioria dos compostos orgânicos absorve uma certa quantidade de luz e, assim que passa pelo feixe de luz aplicado, um detector pode captar a quantidade de luz absorvida. O detector também registra o tempo de retenção dos componentes com base na ordem em que eles saem da coluna. Essa saída pode ser analisada com base na área do pico para determinar a natureza exata dos componentes das amostras.