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O azul genético de uma célula é codificado em seu material genético, ou DNA. Como o DNA nunca sai do núcleo da célula, para que essas informações entrem no citoplasma, onde residem outras proteínas e componentes bioquímicos, é necessário primeiro transcrever o DNA no RNA mensageiro (mRNA ou poli (A) RNA). Esse mRNA é então convertido em proteínas que desempenham muitas funções da célula. Para detectar ou quantificar mRNAs muito raros, fazer sondas para microarranjos ou construir bibliotecas de moléculas de DNA complementares, o mRNA deve ser isolado. No entanto, a extração total de RNA (isto é, todo o RNA de uma célula) e o subsequente isolamento de mRNA não são processos mutuamente exclusivos; o primeiro deve ser realizado para que o mRNA seja extraído.
Isolamento do RNAm do RNA Total
Homogeneização do TRIzol: o RNA total inclui todo o RNAm, o RNA de transferência, o RNA ribossômico e outros RNAs que não codificam. Para separá-los de outros componentes celulares, a célula é aberta primeiro para liberar seu conteúdo. Isso é feito ressuspensando as células granuladas por centrifugação (girando em alta velocidade) no TRIzol Reagent (Life Technologies). Outras versões do TRIzol (como o Reagente TRI da Ambion) funcionam da mesma forma.
Isolamento total do RNA: Uma série de centrifugações é usada para separar os diferentes componentes (proteínas, DNA, RNA) da célula em camadas, ou fases, dentro da suspensão. A fase superior, de cor amarela, é composta de gordura e pode ser descartada. A fase desejada é pintada de vermelho, contém o RNA total e é retida. Após realizar uma extração com fenol-clorofórmio e uma série de lavagens com álcool usando isopropanol e etanol, o RNA pode ser sedimentado para isolamento de mRNA. Adicione inibidores da RNase para impedir que esta enzima degrade o RNA total.
Extração de mRNA: É comum o uso de um kit para isolar mRNAs, pois os protocolos caseiros de laboratório não geram grandes quantidades de mRNAs altamente purificados. Os kits comerciais incluem o FastTrack 2.0 da Invitrogen ou o Kit de isolamento de mRNA puro Poly (A) da Ambion. Essas etapas básicas são comuns a esses kits:
a) Misture o tampão de lise inibido pela RNase fornecido no kit com até 300 microlitros de RNA total.
b) Aqueça por 5 minutos a 65 graus Celsius e depois imediatamente resfrie a amostra em gelo por um minuto.
c) Misture com 0,5 M de cloreto de sódio e dissolva completamente o Oligo dT (ácido oligodesoxitimidílico) nesta amostra.
d) Centrifugue esta amostra e recupere o sobrenadante, que é lavado várias vezes em uma série de tampões de ligação e de baixo teor de sal fornecidos nos kits.
e) Eluir o mRNA várias vezes até obter um volume especificado no kit (por exemplo, 500 microlitros).
f) Precipitar o eluato por precipitação com acetato de sódio e etanol. Ressuspender em até 20 microlitros de água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC).
g) Armazene a -80 graus Celsius e verifique a qualidade e a quantidade por espectrofotometria.