Contente
- A eletroforese possui análise de amostra limitada
- As medições de eletroforese não são precisas
- Amostra inicial substancial é necessária
- Somente certas moléculas podem ser visualizadas
- A eletroforese é baixa produtividade
A eletroforese em gel é uma técnica em que as moléculas biológicas são separadas umas das outras e identificadas em pesquisas biológicas ou diagnósticos médicos. Desde seu desenvolvimento na década de 1970, essas técnicas têm sido inestimáveis na identificação de genes (DNA) e produtos gênicos (RNA e proteína) de interesse da pesquisa. Nos últimos anos, surgiram novas técnicas que dão maior especificidade e detalhes sobre o que está acontecendo nos sistemas vivos. Embora essas técnicas não tenham suplantado as técnicas de eletroforese, e manipulações avançadas possam expandir a viabilidade da técnica, é importante perceber o que a eletroforese em gel pode ou não fazer.
A eletroforese possui análise de amostra limitada
A eletroforese é específica para qualquer tecido que você tenha amostrado. Por exemplo, se você executa um borrão Southern (um tipo de eletroforese) em um cotonete, está olhando para genes das células epiteliais da bochecha e de nenhum outro lugar do corpo. Às vezes, isso pode ser benéfico, mas os pesquisadores freqüentemente se interessam por efeitos mais amplos.
Técnicas como hibridação in situ (ISH) podem levar uma seção de tecido e analisar a expressão gênica em cada pequena área da amostra.Assim, os pesquisadores podem observar todas as áreas do cérebro em uma amostra com ISH, enquanto as técnicas de eletroforese podem observar apenas algumas áreas de cada vez.
As medições de eletroforese não são precisas
A eletroforese em gel pode efetivamente separar proteínas semelhantes com pesos diferentes (esta é uma técnica chamada Western blotting). Pode separá-los mais precisamente através de uma técnica conhecida como eletroforese em 2d; isso é comum em proteômica.
Infelizmente, todas as medidas feitas com esta técnica são semi-quantitativas, na melhor das hipóteses. Para obter a massa (peso) exata das proteínas, a espectroscopia de massa deve ser empregada após a purificação da proteína por eletroforese. Além disso, a comparação das quantidades relativas de moléculas diferentes depende da densidade da banda (escuridão) de diferentes manchas no gel. Esse método tem algum grau de erro e as amostras geralmente são executadas várias vezes para obter resultados limpos.
Amostra inicial substancial é necessária
A eletroforese é uma técnica de isolamento e identificação visual de diferentes biomoléculas. Isso é feito passando uma corrente elétrica através do gel para separar moléculas carregadas de diferentes pesos. Se a molécula em que você está interessado não for comum o suficiente, sua banda será praticamente invisível e difícil de medir.
O DNA e o RNA podem ser amplificados um pouco antes da execução da eletroforese, mas não é prático fazer isso com proteínas. Portanto, é necessária uma grande amostra de tecido para executar esses ensaios. Isso pode limitar a utilidade da técnica, especialmente em análises médicas. É praticamente impossível executar eletroforese em amostras de uma única célula; citometria de fluxo e imuno-histoquímica são mais comumente usadas para avaliar a expressão célula-a-célula de proteínas. Uma técnica chamada PCR é excelente para medir com precisão pequenas quantidades de RNA.
Somente certas moléculas podem ser visualizadas
A eletroforese é excelente na separação e identificação de biomoléculas de tamanho médio a grande. No entanto, muitas das moléculas que os pesquisadores desejam examinar são menores; pequenos hormônios, neurotransmissores e íons não podem ser medidos por eletroforese. Isso ocorre por dois motivos: eles não reagem adequadamente com a preparação de eletroforese (geralmente uma técnica chamada SDS PAGE) e, mesmo se o fizeram, são pequenos demais para separar adequadamente e correm para o fundo do gel. Em vez disso, essas moléculas são medidas por técnicas como RIAAs (radioimunoensaios) e ELISAs (ensaio imunoabsorvente ligado a enzima).
A eletroforese é baixa produtividade
A eletroforese em gel geralmente é de baixa produtividade, o que significa que não produz dados especialmente rapidamente. Eletroforese em contraste, na qual é possível observar um pequeno punhado de moléculas de RNA por vez, com PCR (reação em cadeia da polimerase), que pode avaliar simultaneamente milhares de amostras. Da mesma forma, a citometria de fluxo pode realizar medições de milhares de células individuais e fazer correlações complexas, enquanto a eletroforese examina as células em massa e não pode fazer discriminações tão finas. A PCR e a citometria de fluxo representam processos massivamente paralelos e seriais, respectivamente, e ambos superam as habilidades da eletroforese em gerar dados de pesquisa.