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Um espectrofotômetro é usado para determinar a concentração de certos compostos, como proteínas, em uma solução. Em geral, uma luz brilha através de uma cubeta cheia de uma amostra. A quantidade de luz absorvida pela amostra é medida. Como os compostos absorvem a luz em diferentes faixas espectrais, o comprimento de onda correto deve ser definido para a análise. Existem inúmeras maneiras de calcular a concentração de amostras desconhecidas por espectrofotometria, no entanto, o uso de padrões de referência fornece a melhor precisão. Além disso, os padrões também indicam se o espectrofotômetro está com defeito ou outros problemas com a análise.
Cálculo através de equações de linha reta
Analise os padrões de referência no início da análise. Os padrões são concentrações conhecidas e são usados para calibrar o equipamento e verificar a precisão. Todas as amostras devem estar dentro da faixa de trabalho dos padrões. Caso contrário, as amostras precisarão ser diluídas ou a concentração de padrões aumentada.
Faça um gráfico de dispersão ou gráfico de linhas com leituras padrão de concentração e absorção. A concentração estará no eixo y, a absorção no eixo x. Por exemplo, os padrões são 1 ppm, 2,5 ppm e 5 ppm. A absorvência fornecida foi de 1 ppm = 0,25, 2,5 ppm = 0,5 e 5 ppm = 0,75.
Formate a linha de tendência para exibir uma equação no gráfico. A equação mostrará a fórmula y = mx + b. Por exemplo, usando os padrões na etapa 2, a equação é y = 0,1224x + 0,1531. A maioria das linhas de tendência é interceptada em zero, mas depende do método analítico e do valor do quadrado R.
Analise amostras desconhecidas e registre as leituras de absorvência.
Use a equação (y = mx + b) para determinar a concentração das amostras.
Compreendendo a equação de linha reta
Seja "Y" igual à concentração. É para isso que será resolvido.
Seja "X" igual à absorvência da amostra. Esta é a absorvência medida pelo espectrofotômetro.
Permita que “” seja igual à inclinação e “b” seja igual à interceptação em y. Ambos são dados, no entanto, se a linha de tendência foi forçada a 0, então "b" será 0.
Resolva a concentração. Usando o exemplo na etapa 3, substitua "x" como uma absorção determinada de 0,556. Portanto:
y = 0,1224 (0,556) + 0,151
y (concentração) = 0,222011