Contente
- Enzimas de restrição e sites de restrição
- A orientação correta
- Ligar extremidades pegajosas requer menos DNA
- Enzimas diferentes podem dar o mesmo fim pegajoso
A clonagem molecular é um método comum de biotecnologia com o qual todos os estudantes e pesquisadores devem estar familiarizados. Clonagem molecular usando um tipo de enzima chamada enzima de restrição para cortar o DNA humano em fragmentos que podem ser inseridos no DNA do plasmídeo de uma célula bacteriana. As enzimas de restrição cortam o DNA de fita dupla ao meio. Dependendo da enzima de restrição, o corte pode resultar em uma extremidade pegajosa ou embotada. Extremidades pegajosas são mais úteis na clonagem molecular porque garantem que o fragmento de DNA humano seja inserido no plasmídeo na direção certa. O processo de ligação, ou fusão de fragmentos de DNA, requer menos DNA quando o DNA tem pontas pegajosas. Por fim, várias enzimas de restrição da extremidade pegajosa podem produzir a mesma extremidade pegajosa, embora cada enzima reconheça uma sequência de restrição diferente. Isso aumenta a probabilidade de que sua região de DNA de interesse possa ser cortada por enzimas finais pegajosas.
Enzimas de restrição e sites de restrição
As enzimas de restrição são enzimas que cortam reconhecer sequências específicas no DNA de fita dupla e cortam o DNA ao meio nessa sequência. A sequência reconhecida é chamada de local de restrição. As enzimas de restrição são chamadas endonucleases porque cortam o DNA de fita dupla, que é como o DNA normalmente existe, em locais que estão entre as extremidades do DNA. Existem mais de 90 enzimas de restrição diferentes. Cada um reconhece um site de restrição distinto. As enzimas de restrição clivam seus respectivos locais de restrição 5.000 vezes mais eficientemente do que outros locais que eles não reconhecem.
A orientação correta
As enzimas de restrição vêm em duas classes gerais. Eles cortam o DNA em pontas pegajosas ou cegas. Uma extremidade pegajosa tem uma região curta de nucleotídeos, os blocos de construção do DNA, que não são emparelhados. Essa região não pareada é chamada de saliência. Diz-se que a saliência é pegajosa porque deseja e será emparelhada com outra extremidade pegajosa que possui uma sequência de saliência complementar. Pontas grudentas são como gêmeos perdidos há muito tempo que procuram se abraçar firmemente quando se encontram. Por outro lado, extremidades rombas não são pegajosas porque todos os nucleotídeos já estão emparelhados entre as duas cadeias de DNA. A vantagem das extremidades pegajosas é que um fragmento de DNA humano só pode caber em um plasmídeo bacteriano em uma direção. Por outro lado, se o DNA humano e o plasmídeo bacteriano tiver extremidades rombas, o DNA humano poderá ser inserido cabeça a cauda ou cauda a cabeça no plasmídeo.
Ligar extremidades pegajosas requer menos DNA
Embora o DNA com pontas de bastão tenha mais facilidade em se encontrar por causa de sua "pegajosidade", nem as pontas pegajosas nem as pontudas podem se fundir em um pedaço contínuo de DNA. A formação de um pedaço contínuo de DNA que está completamente ligado requer uma enzima chamada ligase. As ligases conectam a espinha dorsal dos nucleotídeos nas extremidades pegajosa ou embotada, resultando em uma cadeia contínua de nucleotídeos. Como as extremidades aderentes se encontram mais rapidamente devido à sua atração uma pela outra, o processo de ligação requer menos DNA humano e menos DNA plasmídico. As extremidades contundentes do DNA e plasmídeos são menos propensas a se encontrar e, portanto, a ligação das extremidades contundentes requer que mais DNA seja colocado no tubo de ensaio.
Enzimas diferentes podem dar o mesmo fim pegajoso
Os locais de restrição estão localizados em todo o genoma dos organismos, mas não são uniformemente espaçados. Nos plasmídeos, eles podem ser projetados para serem localizados um ao lado do outro. Os cientistas que desejam cortar um fragmento de DNA humano do genoma humano devem encontrar locais de restrição que estão na frente e atrás da região do fragmento. Além de garantir que um fragmento de DNA seja inserido na direção certa, diferentes enzimas pegajosas podem criar a mesma extremidade pegajosa, embora reconheçam diferentes seqüências de restrição. Por exemplo, BamHI, BglII e Sau3A têm sequências de reconhecimento diferentes, mas produzem a mesma extremidade pegajosa do GATC. Isso aumenta a probabilidade de haver locais de restrição de extremidade que flanqueiam seu gene humano de interesse.