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A coloração de Gram é um procedimento de coloração diferencial que mostra quais bactérias são Gram-positivas ou Gram-negativas com base na cor da mancha. O álcool acetona é um reagente usado nesse processo para fornecer a diferenciação de cores. As bactérias gram-positivas têm uma camada peptidoglicana espessa e coloram-se de roxo, enquanto os microrganismos Gram-negativos apresentam uma camada de peptidoglicano pouco a nenhuma e apresentam coloração rosa.
Violeta de cristal de mancha primária
Uma vez preparada uma lâmina de amostra bacteriana, o cristal violeta é usado para manchar a amostra primeiro. Nesse ponto, as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas aparecerão roxas. Normalmente, o cristal violeta é aplicado na lâmina por 30 segundos antes de lavar qualquer excesso de mancha com água. A violeta de cristal pode aderir um pouco às camadas de peptidoglicano para que nem toda a mancha primária seja lavada com a água.
Iodo Mordente
O iodo é então adicionado à amostra por um minuto. Atua como mordente, que serve para fixar corantes em um processo de coloração. O iodo desempenha essa função ligando-se ao cristal violeta e criando um complexo insolúvel que adere muito melhor à espessa camada peptidoglicana encontrada nas células bacterianas Gram-positivas do que apenas o cristal violeta sozinho. Não há etapa de lavagem com água após a adição do iodo.
Descolorante-Álcool
A acetona ou o álcool etílico podem ser usados como agente descolorante. O álcool dissolve lipídios encontrados na membrana celular externa de bactérias Gram-negativas, permitindo que o complexo cristal de violeta-iodo vaze para a camada mais fina de peptidoglicano. O álcool é adicionado por 10 a 20 segundos; é derramado sobre a lâmina até todo o iodo ser lavado e o escoamento ficar incolor. Neste ponto do processo de coloração de Gram, as bactérias Gram-negativas são incolores, enquanto as bactérias Gram-positivas ainda retêm o cristal violeta. Uma vez terminado, o slide precisa ser lavado com água para interromper o efeito de descoloração.
Counterterstain-Safranin
O Safranin é então adicionado para aumentar a visibilidade e o contraste com as bactérias Gram-negativas incolores. A mancha faz com que essas bactérias pareçam rosadas ao microscópio. Como a mancha é adicionada a toda a amostra, também mancha bactérias Gram-positivas, mas a mais escura da violeta de cristal esconde a cor rosa mais clara da safranina. Depois que a amostra da lâmina é inundada com safranina por cerca de um minuto, a água é usada para lavar qualquer excesso de mancha que não aderiu às células bacterianas.