Contente
- O que é eletroforese em gel?
- Componentes da eletroforese
- Moldando o Gel
- Como funciona a eletroforese?
- Carga e tamanho determinam as bandas de DNA
- Aplicações e usos da eletroforese
A eletroforese em gel, também chamada de eletroforese de DNA ou simplesmente eletroforese, é uma técnica usada para separar fragmentos de DNA (e outras moléculas carregadas) de acordo com o tamanho. Isso geralmente é feito usando gel de agarose e carga elétrica para separar fragmentos um do outro.
Essa técnica tem algumas aplicações, incluindo o exame de DNA, digitação de DNA, criminologia e várias aplicações médicas também.
O que é eletroforese em gel?
A eletroforese em gel é uma técnica que permite aos cientistas separar moléculas carregadas de acordo com o tamanho. Isso inclui DNA, RNA e proteínas.
Lembre-se de que o DNA e o RNA têm uma carga negativa leve, graças às moléculas de oxigênio carregadas negativamente no esqueleto de açúcar e fosfato da molécula. As proteínas podem ter uma gama de cargas, dependendo dos aminoácidos dentro da cadeia polipeptídica.
Componentes da eletroforese
Para realizar a eletroforese, primeiro o gel precisa ser produzido. Isso pode ser feito em quase qualquer laboratório; os géis de agarose são mais comuns. Para fazer o gel, o pó de agarose é misturado com um tampão especial chamado tampão de eletroforese. Esta mistura é então aquecida até a agarose ser dissolvida e completamente misturada na solução tampão.
Observe que alguns protocolos de eletroforese exigem a adição de brometo de etídio (Et-Br). Isso mancha qualquer DNA usado na eletroforese para permitir que você veja a posição dos fragmentos sob luz UV.
Moldando o Gel
Este é então derramado em um molde retangular chamado bandeja de fundição em gel. Juntamente com o molde que cria o gel retangular usado para eletroforese, um pente é colocado em uma das extremidades do gel. Este pente faz os poços onde as amostras que você deseja separar por eletroforese são carregadas. Você pode ver uma imagem aqui.
Depois que o gel endurece, o pente é removido e o gel é colocado em um tanque de eletroforese especial. Outro tampão é preenchido no tanque até que uma leve camada de tampão cubra completamente o gel de agarose.
Este tanque produz uma corrente elétrica (variando de 50 a 150 V) através da solução tampão e, por sua vez, através do gel de agarose. Os poços do gel de agarose são colocados na extremidade negativa da corrente (a cátodo) com a outra extremidade do gel na extremidade positiva da corrente (a ânodo).
Como funciona a eletroforese?
Antes de a corrente elétrica passar pelo tanque e pelo gel, suas amostras são carregadas nos poços. Isso é feito usando uma micropipeta. Uma amostra de "marcador", também conhecida como escada de DNA, é uma amostra com tamanhos de fragmentos de DNA conhecidos que podem ajudá-lo a comparar suas amostras e entender os tamanhos da amostra que você está testando.
Muitas vezes um corante de rastreamento (também chamado de corante de carregamento) é adicionado a cada amostra para ajudá-lo a carregar a amostra nos poços. O corante também ajuda a rastrear o movimento das amostras através do gel.
Então, como as amostras realmente se movem pelo gel e se separam por tamanho? Tem a ver com o corrente elétrica que atravessa o gel de agarose junto com o tamanho / estrutura dos fragmentos e gel de agarose.
Carga e tamanho determinam as bandas de DNA
Lembre-se de que, no geral, a carga de DNA é negativo . Portanto, quando essas amostras são colocadas em poços próximos à extremidade negativa da corrente elétrica, isso faz com que o DNA carregado negativamente se mova longe do cátodo (carga negativa) e mova em direção ao ânodo (carga positiva) na extremidade oposta.
Além desse movimento das amostras, a eletroforese também separa as amostras e fragmentos dessas amostras por tamanho. Isto é porque moléculas menores e fragmentos podem mova-se mais rápido e mais facilmente através do gel enquanto moléculas maiores e fragmentos mover mais devagar. Isso significa que pequenos fragmentos se moverão para o final do gel mais rapidamente que os maiores e, como resultado, separam cada fragmento por tamanho.
Depois que o gel é executado por cerca de uma hora (na maioria dos protocolos), a carga é desligada e o gel é analisado. Você verá uma banda retangular distinta, geralmente chamada de banda de DNA ou banda de proteínas, em vários pontos ao longo do gel. Cada banda representa um fragmento que se moveu ao longo do gel.
Aplicações e usos da eletroforese
Existem muitas aplicações para eletroforese em laboratório. Aqui estão apenas alguns: