Contente
- TL; DR (muito longo; não leu)
- Tampão e sal
- Detergentes dissolventes
- Agentes quelantes e inibidores
- Lise Alcalina
Lyse é uma palavra que vem do grego e significa apenas "dividir" ou "estourar". Adequadamente, os termos pertencem ao que acontece às células em um buffer de lise, uma solução que as abre para extrair seu conteúdo. Os cientistas usam tampões de lise ao extrair DNA ou proteínas das células para análise, especialmente no caso de bactérias. O tipo de tampão de lise celular varia de acordo com o tipo de experimento, embora a seguir sejam algumas escolhas comuns.
TL; DR (muito longo; não leu)
Os buffers de lise ajudam a quebrar células abertas, para que seu conteúdo possa ser acessado ou removido. Alguns exemplos incluem sais, detergentes, agentes quelantes e inibidores e alguns produtos químicos alcalinos.
Tampão e sal
Os tampões estabilizam o pH enquanto as células se dividem. O Tris-HCL é um dos produtos químicos mais comuns para tamponar a pH 8. HEPES é outro produto químico comum nesses experimentos. O sal de cloreto de sódio também pode aumentar a força iônica, a concentração total de solutos fora das células. Este último ponto tem alguma importância, pois a água pode se difundir através das membranas celulares, de regiões com baixa concentração de soluto para regiões com alta concentração de soluto.
Detergentes dissolventes
Os detergentes dissolvem as membranas celulares para que o conteúdo das células possa escapar. A estrutura molecular tem e anfipática (isto é, moléculas com uma extremidade que interage prontamente com as moléculas de água, enquanto a outra extremidade hidrofóbica ou "temente à água" não). Eles podem dissolver gorduras formando micelas, pequenos aglomerados onde as caudas hidrofóbicas das moléculas de detergente apontam para dentro em direção às moléculas de gordura. Detergentes comuns incluem dodecilsulfato de sódio ou SDS, NP-40 e tritonX.
Agentes quelantes e inibidores
Os tampões de lise também incluem tipicamente agentes quelantes como ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) ou ácido etilenoglicol tetraacético (EGTA). Esses produtos químicos se ligam a íons metálicos com duas cargas positivas (por exemplo, magnésio e cálcio), tornando-os indisponíveis para outras reações. Muitas DNAs (proteínas que mastigam DNA) e proteases (proteínas que cortam outras proteínas) precisam de íons de magnésio para funcionar, privando-os desse ingrediente chave, o EDTA e o EGTA ajudam a reduzir o nível de atividade da protease ou DNAse. No entanto, eles não descartam completamente, e algumas proteases não dependem de cofatores de magnésio; portanto, os tampões de lise também incluem produtos químicos chamados inibidores de protease, que se ligam a proteases e impedem que funcionem corretamente.
Lise Alcalina
A lise alcalina, uma técnica muito comum para purificar plasmídeos de bactérias, envolve três soluções. O primeiro contém glicose, tampão tris-HCL, EDTA e RNAs. A glicose cria uma alta concentração de soluto fora das bactérias, tornando-as um pouco flácidas, o que as torna mais fáceis de lisar. O EDTA e o tris-HCL funcionam como já descrito, enquanto o RNAse mastiga qualquer RNA dentro da célula para tirá-lo do caminho. A segunda solução realmente lise as células. Este contém detergente SDS e NaOH, que eleva o pH para 12 ou mais, desnaturando proteínas no interior da célula e fazendo com que o DNA se separe em filamentos únicos. A terceira solução contém acetato de potássio para restaurar o pH a um nível mais neutro, para que as cadeias de DNA do plasmídeo possam se unir novamente. Enquanto isso, as proteínas desnaturadas aglutinam e precipitam, enquanto os íons dodecil-sulfato se juntam aos íons potássio para formar um composto insolúvel, que também precipita da solução.